昆虫病原性真菌治療は、リピセファルスマイクロプラスダニの腸内細菌の多様性を変化させます

寄生虫とベクター 16 巻、記事番号: 185 (2023) この記事を引用

141 アクセス

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

マダニは絶対的な吸血寄生虫であり、主に病原体の伝播により、重大な経済的損失や人間や動物の健康への懸念を引き起こします。昆虫病原性真菌は、ダニの統合管理において合成殺ダニ剤と組み合わせて使用できるダニ駆除の代替戦略として集中的に研究されてきました。ここでは、Metarhizium anisopliae 処理後にリピセファルスマイクロプラスの腸内細菌群集がどのように形成されるか、また腸内細菌叢の破壊後に真菌に対するマダニの感受性がどのように影響を受けるかを調査しました。

部分的に充血したメスのマダニに純粋なウシの血液、または血液とテトラサイクリンを人工的に与えました。他の2つのグループには同じ食事を与え、M.アニソプリエで局所的に治療を受けました。腸を解剖し、処理の 3 日後にゲノム DNA を抽出しました。細菌の 16S rRNA 遺伝子の V3 ～ V4 可変領域が増幅されました。

抗生物質を投与せず、M. anisopliae で処理したマダニの腸では、細菌の多様性が低下し、コクシエラ種の発生率が高くなりました。 R. microplus にテトラサイクリンを与えて真菌処理した場合、腸内細菌群集のシンプソン多様性指数とピルー平等係数はより高くなりました。真菌処理群（テトラサイクリンの有無にかかわらず）のマダニは、未処理の雌マダニよりも低い生存率を示しました。以前に抗生物質をダニに与えても、真菌に対する感受性は変化しませんでした。エーリキア属 guated グループでは検出されませんでした。

これらの発見は、これらのマダニを宿主とする子牛が抗生物質治療を受けていても、殺真菌作用が影響を受けないことを示唆しています。さらに、昆虫病原性真菌が R. microplus に充血した雌の腸内の細菌群集に影響を与える可能性があるという仮説は、M. anisopliae に曝露されたダニが細菌の多様性の劇的な減少を示したという事実によって裏付けられています。これは、ダニの腸内細菌叢に影響を与える昆虫病原性真菌に関する最初の報告です。

医学的および獣医学的な意義を持つマダニのマイクロバイオームの重要性は、近年ますます認識されてきています[1、2、3]。これらの研究のほとんどは、ダニ媒介性疾患を理解し、その防除を改善することの重要性によって推進されています。吸血は必須外部寄生生物であるため、マダニは栄養補給のために内部共生生物に依存する必要があります[4、5、6]。リピセファルスマイクロプラスは、熱帯地域で最も広く分布しているダニと考えられています [7]。これは、牛に優先的に寄生する一宿主ダニ種であり、主にバベシアボビス、バベシアビゲミナ、バベシアビゲミナなどの血液寄生虫の伝播により家畜に多大な経済的損失を引き起こします。アナプラズマ限界 [8、9]。

マダニおよびダニ媒介性疾患の生物学における腸内マイクロバイオームの役割を理解するために、抗生物質による治療は、脊椎動物宿主に対して、または人工給餌や注射によってマダニに直接使用されてきました[10、11、12]。マダニの腸内細菌叢の組成が、マダニ媒介病原体の獲得、定着、伝播に影響を与える可能性があることが示されています [13]。 Ixodes scapularis の腸内細菌叢が変化すると、Borrelia burgdorferi の定着が減少しました [11]。それにもかかわらず、その逆のことが起こることも示唆されています。アデゴケら。 [14]は、R. microplusがアピコンプレクサであるタイレリア種に感染すると、腸内マイクロバイオームが変化し、その多様性、種の豊富さ、均一性が非感染ダニよりも低いことを実証しました。

合成殺ダニ剤の散布は通常、ダニ駆除に選択される方法ですが、人間、動物、環境の健康に対する懸念を引き起こし、耐性のあるダニの集団の出現につながっています[15]。昆虫病原性真菌の使用は、ダニ駆除のためのより安全でより持続可能な方法を求める場合の有望な代替手段です[16]。昆虫病原性真菌属 Metarhizium には、農業における生物農薬として最も研究され、利用に成功しているいくつかの種が含まれており [17]、商業的にダニに対して使用できる可能性があります。以前の研究によると、真菌の胞子はダニに接触すると感染し、総合的な害虫管理に使用でき、合成殺ダニ剤の過剰使用を減らすことができます[16、18、19]。それにもかかわらず、ダニと真菌の相互作用、特に真菌に感染したダニの免疫反応および生化学的反応に関して、完全に理解するにはまだ多くの研究が残されている[20、21、22、23、24、25]。私たちが知る限り、ダニの腸内細菌と真菌昆虫病原体の作用を結びつけた報告はありません。ダニの微生物叢は、昆虫病原性真菌に対する感受性に影響を与える可能性がありますか? 昆虫では、答えは宿主に依存しているようです。蚊のハマダラカハマダラカや甲虫のデンドロクトヌス・ヴァレンスでは、宿主の微生物叢が真菌の作用に積極的に寄与しています[26, 27]が、チャバネゴキブリのBlattella germanicaでは実証されませんでした[28]。。

たとえば、ダニのマイクロバイオームの相互作用について知られているのは、主にその生理機能とダニ媒介疾患の生物学への影響に関連しています。 R. microplus の細菌の多様性についての最初の記述は、2011 年に Andreotti らによって行われました。 [29]、さらに最近では、著者らはさまざまな地理的位置に応じて、より多くの発見を説明しています[30]。本研究では、局所治療後の昆虫病原性真菌感染の初期段階が R. microplus の腸内細菌群集の変化をどのように引き起こすのか、また腸内細菌群集の破壊がそのダニの昆虫病原性真菌に対する感受性に影響を与えるかどうかを調査することを目的としました。

1 頭の子牛に R. microplus 幼虫 (ポルトアレグレ株) を人為的に寄生させ (Reck et al. [15])、ブラジルのリオデジャネイロ連邦農村大学 (UFRRJ) の WO Neitz 寄生虫学研究ステーション (CEUA [倫理] [動物使用委員会]/UFRRJ 獣医研究所 - プロトコル番号 9714220419) マダニを子牛に 19 または 20 日間自然に与えた後、手で取り除き、宿主の皮膚から慎重に剥がしました (口の部分を壊さないようにするため) ). 使用した子牛は、実験前 2 か月間、抗生物質または殺ダニ療法を受けていませんでした. R. microplus の人工給餌は、Valim ら [31] および Ribeiro ら [32] から採用されました. 部分的に充血した雌マダニの体重を測定しました、次亜塩素酸ナトリウム (0.05% v/v) で表面を 3 分間滅菌し、ペーパータオルで乾燥させたマダニに人工的に給餌するために使用した血液は、同じ子牛の頸静脈から直接採取されました (CEUA/獣医学研究所、UFRRJ - プロトコル)この実験では、抗凝固剤としてクエン酸塩を含む 3.6 ml チューブ (Vacuplast、トルコ) にダニを真空システムを通じて自然に供給しました。体重約 30 ～ 70 mg の雌マダニに、37 ± 1 °C、相対湿度 80% 以上で、プラスチックチップを使用して純血または血液とテトラサイクリン塩酸塩 (Merck、ダルムシュタット、デラウェア州) を 0.05 mg ml-1 加えたものを 7 時間人工給餌しました。 (RH)。チップには、1 時間ごとに必要なだけ血液 (最大 50 μl) を個別に充填しました。部分的に充血したメスには、最大で平均 350 μl の血液を摂取させました。吸血量を測定するために、人工給餌の前後でマダニの体重を個別に測定しました。最初の体重が 2 倍になったダニのみをさらなる分析の対象としました (メスの体重 0.03 μg のテトラサイクリン mg-1) [12]。

本研究では、真菌分離株 Metarhizium anisopliae sensu stricto LCM S04 [19] を使用しました。培養物を、制御された条件（25±1℃、相対湿度80％以上）下でオート麦培地上で21日間培養した。分生子を、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート (Tween® 80) (Isofar、リオデジャネイロ、ブラジル) 0.01% (v/v) を含む滅菌蒸留水溶液に 1 × 108 分生子 ml-1 で懸濁しました。真菌の生存率は、同じ真菌懸濁液の 1 × 105 分生子 ml-1 のアリコート 20 μl をポテトデキストロース寒天 (PDA) (Kasvi、パラナ、ブラジル) 上にプレーティングすることによって評価されました。分生子発芽は、光学顕微鏡（×400）（ECLIPSE E200; Nikon、東京、日本）を使用して、25±1°Cおよび相対湿度80％以上でインキュベートした24時間後に測定しました。最低 300 個の分生子を評価し、発芽率を計算しました。分生子は、発芽管が見えるときに発芽したとみなされました。実験で使用された真菌懸濁液の生存率は少なくとも 95% でした。本研究はブラジルの遺伝遺産にアクセスしたため、この研究はコード AA47CB6 で遺伝遺産および関連伝統知識管理国家システム (SisGen) に登録されました。

純血または血液とテトラサイクリンを人工的に給餌したマダニ（「リピセファルスマイクロプラス雌の人工給餌」セクション）を、M. アニソプリエ懸濁液で局所的に処理した。それぞれ 10 匹のメスからなる 4 つのグループを次のように確立しました。純血を与えた未処理のダニ (対照グループ) (対照)。血液とテトラサイクリン (T) を投与された未治療のダニ。以前に純血を与えて真菌処理したダニ (F)。以前に血液とテトラサイクリン（T+F）を与えて真菌処理したダニ。人工給餌が終了したらすぐに、ダニを水道水で洗浄して残留血液を除去し、乾燥させ、重量を量った。次に、体重が 2 倍になったマダニをシャーレに両面テープで固定し、1 × 108 分生子 ml-1 20 μl を局所的に処理しました。懸濁液をダニの背部に塗布し、ダニを 25 ± 1 °C および RH ≧ 80% に維持しました。真菌処理の 72 時間後、各グループの 3 人の女性の腸が DNA 抽出のために解剖されました。他のダニの生存を 15 日間毎日記録しました。このバイオアッセイは、分生子と R. microplus ダニの新しいバッチを使用して 3 回実行されました。

R. microplus 雌の腸を、滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) [130 mM NaCl、1 mM KH2PO4、5.6 mM Na2HPO4、2 mM KCl (pH 7.2)] を使用して、滅菌ピンセットとメスの刃で解剖しました。取り出した腸組織を滅菌 PBS で 2 回洗浄し、抽出するまで RNA (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) 中で -80 °C で保存しました。まず、ダニの内臓を液体窒素で凍結し、滅菌乳棒で浸軟させました。腸ホモジネートの DNA は、製造元 (QIAGEN Inc.、米国カリフォルニア州バレンシア) の指示に従って DNeasy Blood & Tissue キットのプロトコールに従って抽出されました。自然給餌および人工給餌に使用した子牛 (B) の血液の DNA も、上記と同じプロトコールに従って抽出されました。

細菌 16S rRNA 遺伝子の V3 ～ V4 可変領域は、プライマー Bakt_341F (CCTACGGGNGGCWGCAG) および Bakt_805R (GACTACHVGGGTATCTAATCC) を使用して、13 サンプル (各グループの腸サンプルからの 3 つと血液対照 [B] からの 1 つ) からのゲノム DNA について増幅されました。 [33]。 Herculase II Fusion DNA ポリメラーゼ (Agilent Technologies, Inc.、米国カリフォルニア州サンタクララ) および Nextera XT Index Kit v2 (Illumina, Inc.、米国カリフォルニア州サンディエゴ) (300 塩基対 [bp] ペア) -end reads) は、Macrogen (韓国、ソウル) 上の 30% PhiX スパイクを備えた Illumina® MiSeq® プラットフォームで使用されました。 bcl2fastq v2.20 パッケージ (Illumina Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) を使用して、バイナリ塩基コールを FASTQ 形式に変換し、配列を逆多重化し、バーコードを削除しました。

アダプターは生データ (1,250,293 個の順方向および逆方向配列) から削除され、品質スコアに基づいてフィルター処理され、R バージョン 4.1.1 (R Core Team 2022) の DADA2 パイプラインバージョン 1.16 [34] と RStudio を併用してトリミングされました。 1.4.1717 (RStudio チーム 2022) [35]。最適化された切り捨てパラメータを計算するために、FIGARO ツール [36] が使用されました。順方向リードと逆方向リードはそれぞれ 270 bp と 215 bp で切り詰められました。 2 つを超える予想エラーのある順方向読み取りと逆方向読み取りはそれぞれ破棄され、読み取りは品質スコア ≤ 2 の最初のインスタンスで切り捨てられました。読み取りエラー率は、エラー率推定とサンプルを交互に行う「learnErrors」関数によって学習されました。収束するまで推論する。アンプリコン配列バリアント (ASV) は「given」関数を使用して推定され、配列は「mergePairs」関数によってマージされました。キメラは、「removeBimeraDenovo」機能を使用したサンプル間のコンセンサスの方法によって、固有の配列のコレクションから削除されました。 T 分類学的割り当ては、DECIPHER v 2.20 R パッケージ [38] の「IdTaxa」関数を使用した SILVA SSU 132 修正データベース [37] に基づいて与えられました。この関数は、標準的なナイーブベイジアン分類法よりも優れた分類パフォーマンスを備えた方法です [38]。 39]。ミトコンドリアゲノム、葉緑体、および非細菌に割り当てられた配列は削除されました。これらの手順の後、レアファクション手順と統計分析のために、3,313 個の ASV が残りの 839,263 個の細菌配列に割り当てられました。

ダニ生存曲線は、GraphPad Prism バージョン 8.4.2 (GraphPad Software、San Diego、CA、USA) を使用して、有意水準 0.05 のログランク検定によって分析されました。他のすべての統計分析は、R ソフトウェアバージョン 4.1.1 (R Development Core Team、ウィーン、オーストリア) と RStudio 1.4.1717 (Posit Software、マサチューセッツ州ボストン) を組み合わせて実行されました。

多変量探索的分析は、「vegan」R パッケージバージョン 2.5-7 を使用して行われました [40]。ベータ多様性は、各サンプルの微生物群集の加重 UniFrac 距離行列を使用した主座標分析 (PCoA) に基づいて研究され、異なる処理による細菌群集間の違いが示されました。レア、スペシャリスト、ジェネラリストの ASV の優位性は、超多数の特殊化閾値 (K = 2/3、P = 0.05) を使用し、多重比較を調整した多項種分類法 (CLAM) によって評価されました [41]。グラフは、ggplot2 R パッケージバージョン 3.3.3 [42] を使用して構築されました。

ASV 間のネットワークの分析は、SpiecEasi R パッケージバージョン 1.1.0 による SparCC 相関のブートストラップ推定を使用して評価され、ノードとエッジの行列が得られました [43]。 Gephi ソフトウェアバージョン 0.9.2 [44] を使用して、有意な相関 (P < 0.01) を持つエッジのみがグラフィック構築用に選択され、接続数 (次数)、間の中心性 (BC)、および相関の符号が強調表示されます。

CTRL グループのダニの生存率は F (χ2 = 81.9、P < 0.0001) および T+F (χ2 = 68.4、P < 0.0001) グループよりも高かったが、T グループ (χ2 = 0.06、P < 0.0001) と差はありませんでした。 P = 0.80)。 F 生存率と T+F 生存率は同様でした (χ2 = 0.5、P = 0.47) (図 1)。両方の真菌処理グループ (テトラサイクリンの有無) のダニは 12 日以内に死亡しました (生存率 0%)。同時に、真菌未処理グループ (ctrl および T) は平均 85% の生存率を示しました。テトラサイクリンを人工的に与えたダニ (T) と与えなかったダニ (ctrl) の間で生存率に差は観察されませんでした。

テトラサイクリンおよびMetarhizium anisopliae処理の有無にかかわらず、人工給血後のリピセファルス・マイクロプラス雌の生存（平均誤差および標準誤差）。アスタリスクは、ロングランク検定による Ctrl と T+F の間の統計的差異 (P < 0.05) を示します。治療: Ctrl - 以前に純血を与えられた真菌未処理のダニ (対照グループ)。 T - 血液とテトラサイクリンを以前に与えられた真菌未処理のダニ。 F - 以前に純血を与えて真菌処理したマダニ。 T+F - 以前に血液とテトラサイクリンを与えて真菌処理したダニ

重み付けされた UniFrac 距離行列に基づく PCoA は、2 つの主軸のみにわたる多変量モデルの合計分散の約 77% を説明しました (図 2A)。このパラメータにより、テトラサイクリンを与えられ、M. anisopliae (T+F) で処理されたダニの腸内細菌群集は、他のニッチとは異なっていました。真菌処理を行わずにテトラサイクリンを加えた血液を与えられたマダニの腸（T）、または純血を与えられ真菌で処理されたマダニの腸（F）は、互いに比較的近い細菌群集構造を示しました。前者のグループ (すなわち、T) のコミュニティも、ctrl グループのダニ (純血を与えられたダニ) の腸内で観察されたコミュニティに近かった。子牛の血液の細菌群集 (B) が最も明確でした。

Rhipicephilus microplus の腸と子牛の血液における細菌群集の構造とアルファ多様性。 ASV の UniFrac 距離加重マトリックスに基づく PCoA ベースのコミュニティベータ多様性分析。グループ間の違いを示します。 B 一意の ASV の数。 C シャノンの多様性指数。 D シンプソンの多様性指数。 E ピルーの均等係数。ドットは平均値の正確な位置を示します。 B ～ E 平均値の後に同じ上付き小文字が続く処理は、Tukey 正直有意差 (HSD) 検定による 5% 有意水準で相互に差異はありません。グループの指定を図 1 に示します。

ベータ多様性の分析では、処理により同様の平均細菌性 ASV 数が示されました (図 2B)。 PCoA の結果と一致して、T+F の腸内で測定されたシャノンの多様性指数 (図 2C)、シンプソンの多様性 (図 2D)、およびピルーの均等性係数 (図 2E) [45, 46] が最も高く、シャノン指数を除き、T が T+F と異ならなかった他の処理で観察されたものとは大きく異なりました。全体として、F は腸内細菌の多様性の最低の指数を示し、次に B、ctrl、T が続き、T+F でピークに達しました。

分類学的プロファイリングにより、高品質フィルター処理された 839,263 個の細菌配列が生成され、3,313 個の ASV に分類されました。分類ランクにおける ASV 分類の範囲は次のとおりです:門 (96%)、綱 (94%)、目 (86%)、科 (75%)、属 (49%)、および種 (5%)。最も多い 19 の家族が全家族の 80% 以上を占めました (図 3A)。すべての処理において、最も豊富な科（全 ASV の 2% 以上）はコクシエラ科（配列の 43.9%）で、続いてアナプラズマ科（8.1%）、ラクノスピラ科（4.9%）、ルミノコッカ科（3.3%）、コマモナダ科（3.0%）でした。）、バクテロイダ科（2.6%）。

マダニの腸と純血における主な A 細菌ファミリーと B 属の構成 (B)。サンプルは、スピアマン相関係数を使用して計算された距離に従って樹状図としてグループ化されました。グループの指定を図 1 に示します。

科に続いて、最も豊富な 19 属が全属の 80% 以上を占めました (図 3B)。最も豊富な属（全 ASV の 1% 以上）は、コキエラ属（43.9%）、アナプラズマ属（6.3%）、バクテロイデス属（2.6%）、連鎖球菌属（1.9%）、エールリキア属（1.8%）、カビバクター属（1.7%）、真正細菌 (1.5%)、乳酸菌 (1.1%)、およびシュードモナス属 (1.1%)。両方ともアナプラズマ科に由来するアナプラズマおよびエーリキアに割り当てられた ASV を除いて、これらの属はすべて異なる科の代表でした。

PCoAの結果（図2A）を裏付けるスピアマンの相関係数によると、BおよびT+Fのダニの腸内の細菌科（図3A）および属（図3B）の組成は、Bで観察されたものとは異なっていました。その他の処理、特に Ctrl キー。他の処理（すなわち、ctrl、T、およびF）では、コクシエラ科の細菌（主にコクシエラ属と考えられる）が優勢であったが、T+F腸ではラクノスピラ科の種が優勢であり、次いでコマモナダ科およびルミノコッカス科の種が続いた。さらに、T+F 治療の腸からのデータには、発生頻度が 0.5% 未満の他のいくつかの細菌ファミリーのクラスターが含まれていました。 B では、アナプラズマ科 (主にアナプラズマ属) が優勢で、次にバルトネラ科 (主にバルトネラに割り当てられます) が続きました。

多項種分類法（CLAM）によれば、細菌クラスレベルまでの濃縮が観察されました（追加ファイル1：図S1）。一般に、ガンマプロテオバクテリア綱の細菌がすべての処理で優勢でした。 CLAM によると、ctrl とのコントラストは、F では桿菌とクロストリジウム属のクラス (追加ファイル 1: 図 S1A)、T+F ではクロストリジウム属と放線菌のクラス (追加ファイル 1: 図 S1B)、およびアルファプロテオバクテリアと桿菌の濃縮を示しました。 B (追加ファイル 1: 図 S1C)。 Ctrl を使用した各処理のニッチ占有率と対比して、ジェネリックレベルまでの強化も観察されました (図 4)。比較に応じて、ctrl グループの濃縮グループ (専門細菌) は異なり、フェカリバクテリウム、アナプラズマ、連鎖球菌が優勢でした (図 4)。

ニッチ占有検定のための多項種分類法 (CLAM)。細菌の属は、各生息地で顕著に目立つ円内にのみ表示されます。ゼネラリスト (灰色)、スペシャリスト (オレンジ、青、緑、ピンク、紫)、およびレア (黒) は、それぞれのパーセンテージで示されます。パーセンテージ値は、各ニッチの一意の ASV の直接数を表します。 AT と Ctrl の比較。 BF と Ctrl の比較。 C T+F 対 Ctrl; Dブラッド対コントロール。グループの指定を図 1 に示します。

グループ T の腸は、特殊な細菌 (51.4%) の顕著な濃縮を示し、ブドウ球菌、コリネバクテリウム、アナプラズマ、およびラクノスピラ科の他の種に関連する ASV を強調しました (図 4A)。真菌処理された女性 (F) の腸内では、特殊な細菌が ASV 全体の 43% を占め、クチバクテリウム、レンサ球菌、ブドウ球菌、ルミノコッカス、フェカリバクテリウム、およびラクノスピラ科およびルミノコッカス科の他の ASV が目立っていました (図 4B)。）。 T+F からの腸内で展示された特殊な細菌種はわずか 27.6% に限られており、エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、コリネバクテリウム属、アネロスティペス属、ファスコラルクトバクテリウム属、エッガーテラ属、およびラクノスピラ科、キサントバクテリア科、およびモラクセラ科に関連するその他の属が豊富に含まれていることを強調しています（図 2）。 4C）。子牛の血液（B）と血液のみを与えられたダニの腸（ctrl）の細菌群集も比較され、それぞれ29.9％と58.1％の割合で専門家が優勢であることが示されました（図4D）。この場合、ctrl と比較して、クチバクテリウム属、フェカリバクテリウム属、およびコリネバクテリウム属に関連する ASV の有意な濃縮が血液中に観察されました。

ASV の共起分析により、調査したさまざまなサンプルで細菌群集を維持する主要な種 (キーストーン種) が明らかになりました (図 5、表 1)。未処理のダニ (ctrl) の腸内細菌群集は、主にエールリキア属とコクシエラ属の 2 つのキーストーン種によって結合されていました。クチバクテリウム属、フェカリバクテリウム属、カビバクター属、バクテロイデス属に関連する 4 つの ASV も役割を果たしました (図 5A)。このネットワークには 83 ノード、1446 エッジ、68.19% の肯定的なインタラクションがありました (表 1)。

16S rRNA 遺伝子に基づく、Metarhizium anisopliae で処理または未処理のリピセファルスマイクロプラス腸内の細菌群集のネットワーク共起解析。ノードのサイズは次数に比例し、色は中間中心性 (BC) の離散間隔を示します。グループの指定を図 1 に示します。

T の細菌コミュニティは、ネットワークの複雑さが最も高かった (ノード = 106、エッジ = 3251、正の相関 = 54.57%)。キーストーン種はカビバクターの ASV と関連し、次いでコクシエラと関連し、程度は低いですがクロアシバクテリウム、バクテロイデス、およびラクノスピラ科およびペプトストレプトコッカス科の他の種と関連していました (図 5B、表 1)。

F のネットワークは 2 番目に高い複雑性 (ノード = 97、エッジ = 2185、正の相関 = 67.19%) を示し、キーストーン種としてコクシエラ属の 2 つの ASV を強調し、次にブドウ球菌、連鎖球菌、放線菌が続きました (図 5C、表1）。テトラサイクリンを与えられ、真菌で処理されたダニ (T+F) では、単一のダニで観察されたものと比較して、ネットワークの複雑さと正の相関の数が低かった (ノード = 74、エッジ = 1247、正の相関 = 44.03%)。処理 (ctrl、T、または F) (図 5D)。テトラサイクリンを与えられ、真菌で処理されたダニ (T+F) の場合、いくつかの ASV が同様の中心性と関連度を示しました。これは、ラクトバチルス属、ユーバクテリウム属、コリデキストリバクター属、プレボテラ属、トゥルーペレラ属、カンピロバクター属、およびファスコラルクトバクテリウム属を含む多くの属の参加を強調しています。

予想通り、子牛の血液の細菌群集ネットワーク (B) は最も複雑ではありませんでした (ノード = 38、エッジ = 140、正の相関 = 48.57%)。このネットワークは、いくつかのASV、主にレンサ球菌、シュードモナス、エシェリヒア/赤癬菌、バクテロイデス、バルトネラ、乳酸桿菌、アナプラズマ、マイコプラズマに関連するものと、ラクノスピラ科に関連する1つのASVによって制御されていました（図5E）。

抗生物質は、臨床的乳房炎 [47] やダニ媒介性疾患 [48] などの感染症の治療に重要な役割を果たしており、成長促進剤として使用できます [49]。それにもかかわらず、真菌治療に対するマダニの感受性に対する抗生物質投与の影響はまだ解明されていない。本研究では、マダニに人工的にテトラサイクリンを与え、昆虫病原性真菌を局所的に投与した。興味深いことに、以前に抗生物質を与えられていたかどうかに関係なく、真菌で治療された雌では同様の生存が観察されました。 Merck Sharp & Dohme Corp. (MSD) の獣医マニュアルによれば、牛に対するオキシテトラサイクリンによる治療は 10 mg-1 kg-1 day-1 です。ここで、人工ダニ給餌のためにウシ血液に添加されるテトラサイクリン濃度は、以前の研究[12]に基づいて、30 mg-1 kg-1 day-1 の割合に従いました。したがって、より高い抗生物質濃度の血液粉を食べさせた場合でも、M. anisopliae に対するマダニの感受性は影響を受けませんでした。これは、牛がテトラサイクリンによる抗生物質療法を受けている場合、雌ダニの感受性は影響を受けないことを示唆しています。

抗生物質と真菌（T+F）で処理したダニの細菌群集には、分類するには稀すぎる配列の割合が最も高く、つまり、これらの細菌種を表す配列の数が分析で考慮するには十分ではありませんでした。したがって、これらの処理を組み合わせることで、広範囲の細菌種の濃縮が可能になった可能性があります。さらに、ニッチ占有分析では、コントロールと比較して、すべての治療グループでジェネラリストよりスペシャリスト種の数が多いことが示され、すべての治療がさまざまなレベルで細菌群集を妨害する可能性があることが示唆されました。細菌クラスの相対的関与（CLAM）の分析（図4）により、Fの細菌分類群がT+Fでも観察されることが明らかになりました。ただし、最も豊富な 5 つの分類群の配列読み取りは、T+F よりも F の方が高かった。したがって、これらの事実は、これらのグループ間の多様性指数の違いを説明します。さらに、F と比較して、T+F では細菌組成が変化した分類群の数が増加しました。ネットワーク共起分析における F と T+F の間の不一致 (図 5) は、細菌と細菌の間の相互作用がどのように行われるかを示しています。各グループのキーストーンの種は異なりました。 T+F グループは、キーストーン種と細菌の相互作用の数が最も少ないのとは対照的に、最も高い多様性指数を示しました (図 3)。キーストーン種は必ずしも豊富ではありませんが、相互作用の数に基づいて他の種に強い影響を与えます [50、51]。したがって、キーストーン種は、その強いつながりにより細菌群集の構成を形作ることができます。 T+F データはより多くの種 (つまり、多様性指数の増加) を示しているにもかかわらず、これらの種は強固な相互作用を確立しませんでした。これはおそらく、これらの種が真菌と抗生物質の併用による破壊によってのみ発生した日和見細菌であるためと考えられます。

内部共生微生物は偏性吸血性節足動物において重要な役割を果たし、吸血食では不足する栄養素を提供します[4、52]。デュロンら。 [5] は、オルニソドロスモウバタがビタミン B 合成を担う内部共生生物フランシセラに依存していると報告しました。ギッツォら。 [12] は、R. microplus にとって、コクシエラは中葉の成熟とダニの生理機能に重要な内部共生生物であることを実証しました。これらの著者らは、コクシエラが R. microplus 雌のさまざまな組織に豊富に存在し、卵巣とマルピーギ尿細管に優勢であるが、腸内には非常に低いレベルであることも示しました。一方、我々の研究では、T+Fを除くすべてのグループにおいて、R. microplus腸内で最も豊富な細菌属はコクシエラであった。 F におけるこの分類群の存在量が高いことは、真菌感染によりダニの腸内でコクシエラが濃縮され、他の分類群が減少し、細菌の多様性が減少することを示唆しています。この結果は、ボーベリア・バッシアナ処理後のハマダラカハマダラカでも観察された[27]。これらの著者らは、真菌処理後に蚊の腸内で共生微生物であるセラチア・マルセッセンスが増加したと報告した。対照的に、ここでは、T+F からの腸は、コクシエラの存在量が最も低く、多様性が最も高かった。このグループでは、コクシエラ菌の存在が減少したのは、おそらくテトラサイクリン投与 (細菌のタンパク質合成を阻害する広域薬剤) [53] と真菌治療の組み合わせの結果であると考えられます。コクシエラの減少により、腸内に他の細菌が侵入することが可能になるようであり、これが多様性の増加を説明できる可能性がある。さらに、ダニの腸内細菌群集で報告されている一部の細菌は、テトラサイクリンに耐性があることが示唆されています [54]。この事実は、耐性に関連するタンパク質がコクシエラ・ブルネティで見つかっているため、テトラサイクリンを与えたダニ(T)でコクシエラの存在量がctrlと比較して減少しなかった理由を説明する可能性がある[55]。

私たちが知る限り、これはダニと腸内細菌と昆虫病原性真菌との相互作用に関する最初の報告です。さまざまな昆虫種を用いた以前の研究[26、56]では、腸内細菌叢の変化が節足動物の宿主に応じて昆虫病原性真菌の作用を改善または阻害する可能性があると報告しました。この結果は、異なる宿主の微生物叢組成の違いによるものである可能性があります。ここで、真菌で治療した雌のダニの生存率は、抗生物質を投与した場合と投与しなかった場合（F または T+F）で同様でした。同様の結果が Ramirez らによって観察されました。 (2018) [57] ネッタイシマカと。これらの著者らによると、たとえ高い真菌接種材料を使用した場合でも、腸内細菌量の減少は昆虫病原性真菌の毒性を変化させなかった。これらの除去された細菌 (抗生物質治療後に除去された細菌) が真菌感染症の成否に影響を与えなかった可能性があります。しかし、この研究は R. microplus の成体雌のみを試験することに焦点を当てているため、未成熟期における細菌群集の破壊の影響は異なる結果をもたらす可能性があります。

本研究では、M. anisopliae 処理の 3 日後のダニの腸を分析しました。今回は、これまで未発表の研究に基づいて選択されました [Mesquita, E.; Golo, PS] は、72 時間後、LCM S04 分生子がすでに発芽し、R. microplus の表皮を貫通し、ダニの内臓に到達していることを示しています。さらに、真菌の作用は時間の経過とともに節足動物の体の劣化を引き起こし、解剖方法を妨げます。したがって、細菌と真菌の相互作用に関して 72 時間後に何が起こったのかはまだ解明されていません。コクシエラ属、エーリキア属、カビバクター属、クチバクテリウム属、およびエシェリヒア/赤ん菌は、ctrl グループの腸内で観察される最も一般的な属でした。血液サンプルと Ctrl グループは配列の 0.9% のみを共有し、次に Ctrl と T+F が続き、ジェネラリストは 0.1% でした。腸内で確認された細菌は、主に経卵巣感染、世代を超えて、宿主の皮膚を介して受け継がれる可能性があります[4]。ここで使用された子牛にはアナプラズマ症の臨床徴候は見られませんでしたが、血液サンプルの分子分析により、この動物の血液中に最も豊富に存在する細菌属がアナプラズマであることが示されました（図 3）。ただし、この事実は血中のアナプラズマの存在量が他の細菌よりも多かったということを示しているだけであり、必ずしも感染レベルが高いというわけではありません。ダニの腸には侵入微生物に対する防御戦略があるため、宿主の血液とダニの間で分類群が失われることは、血液の消化プロセスを通じて起こる可能性があります。この防御は主に、ヘモシジンと呼ばれるヘモグロビン抗菌剤由来のフラグメントによって駆動されます[58]。これに加えて、腸の防御機構には抗菌ペプチドやおそらく活性酸素種などの分子が含まれます[59]。

エールリキア属は、ctrl グループの腸で検出されましたが、F、T、または T+F では検出されませんでした。 2016 年に、Cabezas-Cruz らは [60] は、牛にとって病原性のある R. microplus 血リンパから分離された新種 Ehrlichia minasensis について記載しました。現在までに、牛に自然に感染することが知られている種は E. minasensis と E. ruminantium だけです [61、62]。本研究ではエールリキア属の同定やその生活環における考えられる影響については言及されていないが、真菌処理されたダニの腸内でこの属が検出されなかったことは、昆虫病原性真菌感染が発生に悪影響を及ぼす可能性があるという仮説を裏付けるものである。ダニ媒介性疾患を引き起こす細菌。研究では、節足動物を真菌（すなわち、Glossina fuscipes fuscipes および Trypanosoma congolense）で処理した後のベクター媒介病原体の伝播と生活環における昆虫病原性真菌の影響を報告している [63] だけでなく、ハマダラカハマダラカおよび熱帯熱マラリア原虫 [64] ]。それにもかかわらず、私たちの知る限り、特に昆虫を使った研究と比較したダニ-病原体-真菌の相互作用に関する文献は存在しません。ここで、昆虫病原性真菌メタヒジウム（抗生物質との併用または非併用）によるダニの腸内微生物叢の破壊は、ダニに対する使用においてこの真菌の利用可能な特徴を示している。ただし、ここでの分析はダニの腸のみを中心としており、他のダニ組織は対象としていません。したがって、ダニ対病原体対真菌の間の三者相互作用についてはさらなる研究が必要である。

R. microplus に M. anisopliae を攻撃すると、主に内部共生生物である Coxiella の濃縮が増加することにより、ダニの腸内細菌群集が変化します。テトラサイクリン投与と M. anisopliae 治療は、コクシエラ菌の個体数を劇的に減少させ、細菌の多様性を増加させることで R. microplus の腸内細菌群集を変化させます。それにもかかわらず、抗生物質による治療は、昆虫病原性真菌に対するマダニの感受性に影響を与えません。

この研究のペア配列と BioSamples 割り当ては、NCBI リポジトリでプロジェクトコード PRJNA849240 として入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

ブラジルのUFRRJの微生物制御研究所（LCM）と家禽健康研究所（LASAVE）の学生の支援に感謝します。

リチャード・アラン・ハンバー - 引退。

この研究は、修士号と博士号を提供するブラジル最高経営責任者調整局 (CAPES) の財政コード 001 によって一部資金提供されました。 LN メイレレスと TA コレア、およびブラジルの国家科学技術開発評議会 (CNPq) に奨学金を提供し、博士号を提供しています。 E.メスキータの奨学金。この研究は、リオデジャネイロ州研究カルロス・シャーガス・フィリョ財団（FAPERJ）からの助成金（助成金番号 E-26/201.389/2021）によって支援されました。 VREP Bittencourt、HA Santos、IS Coelho は CNPq の研究者です。

リオデジャネイロ連邦農村大学獣医学研究所獣医学大学院プログラム（ブラジル、セロペディカ）

エミリー・メスキータ、ラウラ・ノブレガ・メイレレス、タイス・アルメイダ・コレア、ヴァニア・リタ・エリアス・ピネイロ・ビッテンコート、パトリシア・シルバ・ゴロ

微生物学および酵素学研究所、アグレステペルナンブコ連邦大学、Garanhuns、PE、55292-270、ブラジル

ディオゴ・パエス・ダ・コスタ

リオデジャネイロ連邦農村大学獣医学部、動物寄生虫学部門、セロペディカ、RJ、ブラジル

マリアナ・グエデス・カマルゴ、ヴァニア・リタ・エリアス・ピネイロ・ビッテンコート、パトリシア・シルバ・ゴロ

リオデジャネイロ連邦農村大学獣医研究所獣医微生物学および免疫学部、セロペディカ、RJ、ブラジル

イレーネ・ダ・シルバ・コエーリョ

リオデジャネイロ連邦農村大学獣医学部疫学公衆衛生局、セロペディカ、RJ、ブラジル

ハリソン・アゼベド・サントス

USDA-ARS 新興害虫および病原体研究、RW ホーリー農業健康センター、イサカ、ニューヨーク州、14850、米国

リチャード・アラン・ハンバー

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

EM、HAS、ISC、PSG がこの実験を考案しました。 EM、LNM、MGC、TAC が実験を実施しました。 DPC は、データとグラフィックアートの統計的およびバイオインフォマティクス分析を実行しました。 EM、ISC、HAS、DPS、PSG が結果を分析し、原稿を執筆しました。 VREPB、MGC、PSG、ISC、HAS、DPS、および RAH は、技術的および科学的正確さを期して原稿を改訂しました。 PSGとVREPBが資金を獲得し、プロジェクトを監督した。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

パトリシア・シルバ・ゴロへの通信。

適用できない。

著者は利益相反がないことを宣言します。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

多項種分類法 (CLAM) に基づく、ネットワーク上の各構成ニッチにおける細菌クラスの相対的な参加。ボックス内のパーセンテージ値は、各ニッチの生の ASV スケールに対して計算されました。 T (A)、T+F (B)、および B (C) 治療と対照との比較は、コントラストが大きいため強調表示されました。対数 (ASV+1) 変換に基づくパーセンテージが括弧内の縦軸に表示されます。治療: Ctrl - 以前に純血を与えられた真菌未処理のダニ (対照グループ)。 F - 以前に純血を与えて真菌処理したマダニ。 T+F - 事前に血液とテトラサイクリンを与えて真菌処理したダニ。 B - 子牛からの純血サンプル。

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転載と許可

Mesquita、E.、da Costa、DP、Meirelles、LN 他。昆虫病原性真菌の治療により、リピセファルスマイクロプラスダニの腸内細菌の多様性が変化します。寄生虫ベクター 16、185 (2023)。 https://doi.org/10.1186/s13071-023-05790-5

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受信日: 2023 年 2 月 15 日

受理日: 2023 年 4 月 27 日

公開日: 2023 年 6 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05790-5

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