乳牛の代謝、消化率、臓器発達および遺伝子発現に対するエッセンシャルオイルのブレンドの潜在的な利点

Scientific Reports volume 13、記事番号: 3378 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

この研究の目的は、血球と代謝産物、インスリン様成長因子-1 (IGF-1)、消化率、内臓の重量と組織学、遺伝子発現、およびアブラナを補給した離乳前の雄牛の脾臓細胞の増殖を評価することでした。代替乳（MR）にエッセンシャルオイルをブレンド。出生時の体重が 33.3 ± 3.7 kg である 16 頭の新生ホルスタイン種とギア種を交配した乳用雄牛の子牛を、個別の砂床囲いに収容し、遺伝的組成によってブロックし、ランダム化完全ブロック設計で 2 つの治療法のうち 1 つにランダムに割り当てました。（CON、n = 8）およびエッセンシャルオイルのブレンドサプリメント（BEO、n = 8、1 g/日/子牛、Apex Calf、Adisseo、中国）。市販のブレンドは、アニス、シナモン、ニンニク、ローズマリー、タイムに由来する植物抽出物で構成されています。動物には、１５％（乾物ベース）で戻したＭＲを１日５Ｌ、２回の等しい食事に分けて与えた。水およびスターターを自由に与えた。 β-ヒドロキシ酪酸、尿素、およびグルコースは毎週評価され、IGF-1は隔週で評価され、総血球数は試験が終了する8週齢まで4週間ごとに測定されました。飼料サンプルは週に 3 回収集され、毎週の分析のためにポーリングされました。見かけの総栄養素消化率は、年齢 56 日から 60 日までに測定されました。 60±1日目に、臓器重量、組織学、脾臓細胞増殖、および腸の遺伝子発現分析のために動物を安楽死させた。データは、継続的な結果を得るために、R の nlme パッケージの REML メソッドを使用した線形混合モデルを使用して独立して分析されました。 R の Artools パッケージを使用して、順序付けられたカテゴリカルな結果に対してノンパラメトリック検定が使用されました。血液評価、消化率、遺伝子発現、脾臓細胞増殖アッセイについては、グループ間に差はありませんでした。しかし、BEO 子牛は、より重い膵臓、より重い腸、より大きな回腸絨毛、およびより高い盲腸酪酸レベルを示し (P < 0.05)、EO の補給が腸の発達と共生細菌を助けることを示しています。これは、CON 動物のより重い気道とより高い好酸球数でも観察されました (P < 0.05)。したがって、好酸球がより活性な臓器は、BEO 動物に対してより良い反応を示しました。免疫関連における腸の遺伝子発現には差異は見られませんでした。これらの結果は、MRでエッセンシャルオイルを補給することが腸の発達と免疫機能に貢献する可能性があることを示しています。しかし、体の発達に対するその影響を理解し、最適な投与量と投与経路を定義するには、さらなる研究が必要です。

家畜の成長促進剤として抗菌薬を使用することは、特に細菌耐性と健康概念を生み出す可能性があるため、最近疑問視されています1,2,3。家畜、特に新生児疾患の治療に使用される抗菌薬は、人間の医療で使用されているものと同じ薬剤が使用されているため、懸念されています2,4。さらに、病気の予防や治療に抗菌薬を誤って使用すると、病原体の回復力が高まり、腸内細菌叢の異常によって宿主の免疫系が弱まる可能性があります 6,7。また、動物福祉は、動物の健康と酪農場での抗菌薬の使用、つまり動物の状態と幸福を評価するために測定される項目と相関していることも指摘しなければなりません5。したがって、酪農場における病気を治療するための抗菌薬の使用とその使用の合理化に関する政策は、いくつかの国内獣医団体によって常に更新されています1。

離乳前の期間は、酪農場において死亡率が最も高い段階です4,5。子牛は免疫系がまだ未熟なため、腸疾患や呼吸器疾患にかかりやすい6。胃腸管 (GIT) は免疫系の最大の器官です7。したがって、腸内微生物叢は腸外での免疫応答の調節に重要な役割を果たしているため、この部位での微生物の良好な定着を確保し、改善することが重要です8。腸内微生物叢は、子牛のパフォーマンスと健康を最適化するために非常に重要です9。しかし、高齢の動物でルーメンと腸のマイクロバイオームが一旦定着し、完成すると、この生態系を永続的に操作することは困難です13。このため、子牛の腸内細菌叢を若いうちに操作し、発達させることが重要なのは、それが代謝、成長、免疫反応を媒介する機会となるからです9,10。

したがって、一部の食習慣や添加物は、栄養素の利用や共生微生物叢の恒常性、特に幼少期の動物の免疫反応に影響を与える可能性があります11、12、13。生後最初の数日間の初乳と移行乳の補給、第一胃経ファウンテーション接種、プレバイオティクスとプロバイオティクスの補給は、子牛の微生物の定着と腸の発達を操作および改善し、その結果免疫系を改善するために使用される可能性のある戦略です9,14。したがって、飼料添加物は、家畜の能力を向上させるだけでなく、抗炎症作用、抗菌作用、ルーメン調節作用、抗酸化作用、免疫学的改善作用の代替として模索されてきました15。成長促進剤の使用の選択肢となる可能性のある飼料添加物の補給の中で、引き続きホットな話題はエッセンシャルオイル (EO) です。

EO は、抗菌、抗ウイルス、抗真菌、抗酸化、抗炎症作用を持つ植物代謝物の天然抽出物であり 16,17 、腸内微生物叢 18 と子牛のパフォーマンス 19 に有益です。これらの油のそれぞれでは、異なる作用を持つ異なる分子だけでなく、EO を得るために異なる植物が使用されます 17,20。したがって、最近では、第一胃の生態系と微生物叢を改変し、人生の初期段階での栄養素の利用、パフォーマンス、および健康を改善するために、これらの EO の組み合わせまたはブレンドを使用した添加剤がテストされています9。流動食を通じてさまざまな植物の EO を使用した以前の結果では、子牛の成長と健康改善に潜在的な利点が示されています 21 が、若い反芻動物への EO の使用に関する情報はまだ限られています。

この研究は、乳代替品 (MR) に含まれる EO サプリメントの市販ブレンドが、離乳前段階の乳用雄牛の免疫、栄養素の消化率、器官発達、および遺伝子発現に及ぼす影響を評価することを目的としていました。パフォーマンスとキャリーオーバー効果は以前の研究で評価されており、本研究では説明的な目的で実証されました。私たちは、流動食による EO の補給が免疫反応を強化し、腸の発達を助け、その結果、栄養素の消化率を高めることができるのではないかという仮説を立てました。

この実験では、エンブラパ (ブラジル農業研究公社) 乳牛倫理委員会によって承認されたプロトコル番号 9078250118 に基づいて、動物の管理および使用プロトコルのガイドラインに厳密に従いました。エンブラパはブラジル農業・畜産・食料供給省によって設立されました。

この研究は、2018年3月から7月にかけてエンブラパ乳牛施設（ブラジル、コロネル・パチェコ）で実施されました。平均初期体重33.3±3.7kgの16頭の新生ホルスタイン種および交雑種（ホルスタイン×ジャー）雄牛が直ちに母牛から引き離されました。生後、この試験に使用されました。生後6時間は体重の10％の良質な初乳（ブリックス＞23％）を与え、生後3日間はへその緒を10％ヨウ素溶液に浸漬させた。雄牛の子牛は、側面が開いた納屋の砂敷きの囲い (1.25 × 1.75 m) に個別に入れられ、長さ 1.2 m の鎖でつながれました。生後最初の日からすべての実験期間中、水と市販の子牛スターター (Soymax Rumen pre-initial Flocculated、Total Alimentos、Três Corações、ブラジル、表 1) を自由に与えました。

流動食は、ゴム製乳首を備えたバケツ（ミルクバー、ニュージーランド）で１日２回（午前８時と午後１６時）与えられた。生後 2 日目と 3 日目に、子牛には 1 日あたり 5 L の移行用ミルクを 2 回の食事に等分して与えられ、4 日目から 60 日目までは、1 日あたり 5 L の代替乳を 2 回の食事に等分して与えられました (MR、カルボラック) 、Ｎｕｔｒｉｆｅｅｄ、オランダ；表１）、全固形分の１５％、粗タンパク質１９４ｇおよび脂肪６０ｇを提供するように再構成された。受動免疫転移は3日目にチェックされ、頸静脈穿刺によって血清サンプルが収集されました。チューブを室温で 30 分間放置し、その後 1800 xg で 10 分間遠心分離しました (22 ～ 25 °C)。遠心分離後、血清をブリックス屈折計 (Aichose 屈折計、中国山東省新達城市) で評価しました。子牛は、Brix が 8.4% より高い場合にのみ登録されました。

4 日目に、雄牛を次の 2 つの治療のうちの 1 つにランダムに割り当てました：（i）対照（CON、無添加、n = 8）および（ii）エッセンシャルオイルのブレンド補給（BEO、1 g/日/子牛、アペックスカーフ、アディセオ、中国; n = 8)。両方の治療がバランスよく行われていることを確認するために、割り当て中に誕生月、体重、Brix がチェックされました。アペックスカーフ (アペックスカーフ、アディセオ、中国) は、アニス、シナモン、ニンニク、ローズマリー、タイム由来の植物抽出物のブレンドを含む市販の添加物です。この添加剤は、メーカーの推奨に従って実験中に MR に組み込まれました。各食事の添加物の量を事前に秤量し、暗箱内の 15 mL チューブに保管しました。この量を 10 mL の MR と混合し、均質化し、0.49 L の MR (朝の食事で 0.5 g/子牛、午後の食事で 0.5 g/子牛) に組み入れて、製品の総摂取量を確保しました。動物が０．５ｇの添加剤を含む０．５ＬのＭＲを摂取し終えるとすぐに、バケツに残りのＭＲを再充填した。

記述的な目的で、飼料摂取量 (MR、スターター、および水)、パフォーマンス、および体格の発達を生後 4 日から 60 日の間で測定しました。飼料摂取量は、与えられた量から拒否を差し引くことによって毎日計算されました。 MR とスターターのサンプルを週に 3 回収集し、栄養素分析用の毎週のプールを取得しました。

体重 (BW) と体格の発育 (身長 (WH)、臀部の高さ (RH)、および心臓周囲径 (HG)) を毎週、朝の食事前に体重計 (ICS 300、Coimma、Dracena、ブラジル）、携帯用血圧計と巻尺。

飼料の消化率は、試験の最後の 5 日間、年齢 56 日から 60 日の間で実施されました。毎日の糞便収集を可能にするために、ゴム製マット (WingFlex、Kraiburg TPE GmbH & Co.、Waldkraiburg、Germany) を各個別の小屋に置きました。糞便を収集し、56日目から60日目まで毎日重量を測定し、さらなる分析のために-20℃で凍結した。５９日目に動物を代謝ケージ（１．５×０．８ｍ、Intergado Ltda.、Contagem、ブラジル）に移し、２４時間の採尿と糞便サンプリングの最終日に行った。試験中に尿を保存したフラスコは、細菌の増殖と窒素の損失を避けるために、氷で覆われたクーラーの中に置かれました。収集期間後、尿の総量、重量、密度が記録され、サンプルはさらなる分析のために -20 °C で凍結されました。消化率試験中、MR、スターター、および拒否サンプルが収集され、5 日間プールされ、さらなる分析のために -20 °C で保存および凍結されました。

スターターサンプルと MR サンプルは、毎週および消化率試験中に収集されました。消化中に収集された糞便は、55 °C で 72 時間オーブンで乾燥され、分析のために Wiley ミル (モデル 3、Arthur H. Thomas Co.、フィラデルフィア、ペンシルバニア州) で 1 mm のふるいを通して粉砕されました。それらを分析して、AOAC23に従って、乾燥物（DM、メソッド934.01）、粗タンパク質（CP、メソッド988.05）、エーテル抽出物（EE、メソッド920.39）、灰分（メソッド942.05）を測定しました。中性洗剤繊維 (NDF) と酸性洗剤繊維 (ADF) の濃度は、Van Soest et al.24 によって記載された方法を使用して順番に測定されました。総エネルギーは、断熱爆弾熱量計（Parr Instrument Company、イリノイ州モリーン）を使用して測定した。

各栄養素の見かけの消化率 (%) は、栄養素摂取量 (NI) と栄養糞便回収率 (NFR) を考慮して、次の式を使用して決定されました。

窒素バランスは、窒素摂取量 (NI)、糞便窒素 (NF)、および尿中窒素 (NU) の差によって次の式を使用して決定されました。

総エネルギー摂取量 (GEI) は、次の式を使用して、提供された食事の総エネルギー (スターター総エネルギー (GES) および MR 総エネルギー (GEMR)) と拒否総エネルギー (GER) の差によって決定されました。

消化可能エネルギー摂取量 (DEI) は、GEI とエネルギー糞便排泄量 (GEF) の差によって決定されました。代謝エネルギー摂取量 (MEI) を決定するために、尿からのエネルギー損失 (GEU) が DEI から差し引かれました。

ベースラインを得るために、出生時に初乳摂取前に頸静脈の血液サンプルを採取しました。その後、朝の授乳の 3 時間後に毎週採取して、抗凝固剤を含まないチューブでβ-ヒドロキシ酪酸（BHB）、血清尿素、フッ化ナトリウムチューブで血漿グルコース、および隔週で血漿 IGF-1 の濃度を測定しました。ヘパリンチューブ (ブラジル、オザスコの労働輸入)。チューブを室温 (22 ～ 25 °C) で 3000 × g で 10 分間遠心分離し、各サンプルの複製を個別にマイクロチューブに割り当て、さらなる分析のために -20 °C で凍結しました。 BHB および尿素の血清濃度は、市販のキット (Ranbut-D-3-Hidroxybutyrate、Randox Laboratories Ltd.、アントリム、英国;尿素 UV、Kovalent do Brasil Ltda.、Bom Retiro São Gonçalo、ブラジル)。血漿グルコースは、酵素比色法（Kovalent do Brasil Ltda.、リオデジャネイロ、ブラジル）を使用して、マイクロプレート分光光度計EON（Biotek Instruments Inc.、バーモント州ウィヌースキ）で測定しました。血漿ＩＧＦ−１濃度は、化学発光アッセイ（Ｉｍｍｕｌｉｔｅ２０００Ｓｙｓｔｅｍｓ１０３８１４４、ＩＧＦ−１２００、ＳｉｅｍｅｎｓＨｅａｌｔｈｃａｒｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＰｒｏｄｕｃｔｓＬｔｄ．、Ｌｌａｎｂｅｒｉｓ、Ｇｗｙｎｅｄ、英国）を使用して分析した。

0日目、30日目、および60日目に、頸静脈穿刺により全血球計算のために血液サンプルをEDTAチューブ(Labor Import、Osasco、ブラジル)に採取し、直ちに氷上で研究室に輸送した。自動血液細胞計数器（SDH – 3 vet、Labtest Diagnostica SA、ブラジル）を使用して、赤血球数（RBC）、濃厚細胞体積（PCV）、ヘモグロビン（Hb）、平均赤血球体積（MCV）、平均値を評価しました。赤血球ヘモグロビン濃度 (MCHC)、血小板および総白血球数。手動白血球分画計数も、総白血球数、好塩基球、好酸球、好中球、バンド好中球、分節好中球、リンパ球、および単球について顕微鏡倍率 1000 倍で 100 個の白血球を評価する顕微鏡検査によって実行されました。毒性好中球、反応性リンパ球、活性化単球などの形態学的変化が計算されました。以前の結果を使用して、血小板対リンパ球比 (PLR) および好中球対リンパ球比 (NLR) を計算しました。 PRL と NRL は新規の炎症マーカーであり、ヒトの医学ですでに行われているように、炎症と死亡率を予測するためのバイオマーカーとして 25、炎症と適応免疫のバランスをとって疾患の経過を予測するためのバイオマーカーとして適用できるかどうかを検証するために選択されました 26。

ブラジル連邦獣医学評議会が推奨する手順を使用して、内臓の発達を比較するために、すべての雄牛を 60 ± 1 日目に安楽死させました 27。気絶させて屠殺した直後に、体内の循環血液を排出するために頚静脈が切断された。次いで、腹腔を開き、消化管の各領域を隔離して結んだ。内臓と身体部分を次の順序で取り出し、重量を量ります: 脾臓、膀胱、全腸管、肝臓、膵臓、大網、腎周囲脂肪、腎臓、前胃 (第一胃-第四胃、第三胃)、第四胃、小腸、大腸、舌、心臓、肺 + 気管。この後、生物学的内容物を含む臓器を空にし、再度重量を測定した（膀胱、第一胃小胞体、第三胃、第四胃、小腸および大腸）。臓器の重量は、空の動物の重量に比例して評価されました。したがって、動物の体液の重量が動物の生体重から差し引かれました。小腸と大腸の長さは、メートルテープを使用して測定されました。第一胃液および盲腸液サンプルを直ちに採取して、pH、VFA、および NH3-N を測定しました。これらの手順の後、一部の部品を空にし、再度計量しました。

組織学的比較のために、約 9 cm2 の面積のサンプルが収集されました: 第一胃腹嚢、第一胃背嚢、第三胃層、第四胃、十二指腸 (第四胃下 10 センチ)、回腸 (回腸と盲腸の接合部の 40 cm 前)、および結腸 (40 cm)回腸と盲腸の接合部の後）。組織サンプルを直ちにホルマリンを入れたフラスコに入れて固定しました。固定から 48 時間後、ホルマリンを 70% アルコールに置き換え、光から保護しました。サンプルはパラフィンを含むように処理され、手動ミクロトーム (Olympus CUT 4055、東京、日本) を使用して 5 μm の厚さに切片化されました。形態計測分析では、ヘマトキシリン・エオシンを使用してシートを着色しました。画像は、Cell-B ソフトウェア（オリンパス、東京、日本）を使用して、カメラ（オリンパス OSIS SC30、東京、日本）に接続された光学顕微鏡（オリンパス CX31、東京、日本）を使用してキャプチャされました。形態計測的解釈には、AxioVision 4.8.2-06/2010 (Carl Zeiss Images Systmes®237、イエナ、ドイツ) を使用しました。第一胃と第三胃のサンプルについて、乳頭の面積、高さ、上皮基底層の有糸分裂指数 (MI) を分析しました。 MI を決定するために、光学顕微鏡を使用して 2000 個の基底層細胞を数えました。推定では、有糸分裂中の細胞数とカウントされた細胞の総数の間の比率が考慮されました28。十二指腸および回腸領域の絨毛の高さ（μm）および面積（μm2）。十二指腸、回腸、結腸領域の胃窩と陰窩の深さ（μm）を測定しました。細胞増殖は、胃腺および腸腺の上皮における有糸分裂像の数を 10 領域でカウントすることによって決定され、400 倍に増加しました。

ルーメン液サンプルは、朝の授乳の 4 時間後に食道チューブを使用して 14、28、42、および 60 日目に採取されました。安楽死当日、動物の第一胃と盲腸から直接サンプルを採取しました。ルーメンの pH を、pH メーター (Phmetro T-1000、Tekna、Araucária、ブラジル) を使用して直ちに測定しました。次いで、濾過したルーメン液 10 ミリリットルを VFA 分析の場合は 20% メタリン酸 2 mL で酸性化し、NH3-N 分析の場合は 0.2 N 50% 硫酸 10 ミリリットルを酸性化しました。これらのサンプルは、さらなる分析のために -20 °C で保存されました。 NH3-N 濃度については、Chaney と Marbach によって提案された比色蒸留法が使用され 29、酸化マグネシウムと塩化カルシウムによるケーダール蒸留後に 630 nm で吸光度が測定されました (Termo Fisher Scientific、マディソン、米国)。 VFA第一胃濃度はガスクロマトグラフィーにより測定した。それらを解凍し、13,000 rpm、13 °C で 15 分間遠心分離しました。上清を収集し、濾過し、前述のように分析しました 22。

脾臓の機能は、自然免疫応答と適応免疫応答を組み合わせて、古い赤血球、微生物、および細胞残骸を循環から除去します。これは、抗菌および抗真菌免疫反応にとって最も重要な器官です 30。細菌抗原に対する細胞増殖を評価するために、動物を屠殺し臓器を単離した直後に脾臓の測定を行い、すぐに処理するために氷の中に入れました。

５グラムの組織を研究室で粉砕し、単核球を単離するためにFicoll-Hypaque溶液で400gで30分間密度勾配遠心分離した（Sigma、米国）。脾細胞 (5 × 106 細胞/ウェル) を平底のマイクロ培養プレートに播種し、大腸菌由来のリポ多糖 (10 ng/mL; Sigma、USA) または Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) で刺激しました。 ; 25 ng/mL)、または Smith and Halls に従って単離されたウシ ETEC 株のストレプトマイシン耐性誘導体からの大腸菌 B41 系統抽出物 (20 ng/mL)。大腸菌Ｂ４１系統の単離されたコロニーを溶解物とし、プロテアーゼ阻害剤（プロテアーゼ阻害剤セット、シグマ、米国）のカクテルを添加したＰＢＳ緩衝液で希釈した。大腸菌と LPS が選ばれたのは、大腸菌が生後数週間の子牛の下痢の最も重要なメディエーターの 1 つであるためです 32。したがって、細胞増殖に対する EO の間接的な効果を視覚化することは良い選択となる可能性があります。

次に、脾臓からの単核細胞を、10% 熱不活化ウシ胎児血清 (Gibco、米国)、2 mM L-グルタミン (Sigma、米国)、100 μg/mL のストレプトマイシンを含む RPMI 1640 培地 (Sigma、米国) で培養しました。、および 100 U/mL のペニシリン (Sigma、米国)、37 °C、5% 加湿 CO2 中で。細胞増殖は、陰性対照として非刺激細胞を使用し、製造業者の指示（Sigma）に従ってMTTアッセイ（臭化3-(4,5-ジメチルチアゾイル)-2,5ジフェニルテトラゾリウム; Sigma、米国）によって分析した。簡単に説明すると、刺激された脾細胞を 5% 加湿 CO2 インキュベーター内で 37 °C で 48 時間インキュベートしました。その後、10 μL の MTT (5 mg/mL) を各ウェルに添加し、37 °C で 4 時間インキュベートしました。上清を注意深く吸引し、150 μL の DMSO を各ウェルに加えました。プレートをさらに 10 分間振盪し、ELISA リーダーを使用して 570 nm で吸光度の値を読みました。吸光度値を刺激群と非刺激群間で比較した。

バフィーコート細胞、腸骨、および結腸生検からの遺伝子発現分析は、RT-qPCR によって実行されました。簡単に説明すると、CON (n = 8) および BEO (n = 8) グループの末梢全血を 30 日目と 60 日目に収集し、バフィーコートを分離するために室温で 800 g で 10 分間遠心分離しました。白血球と血小板（バフィーコート）は赤血球の上に層を形成し、マイクロピペットで注意深く除去されました。製造業者の指示に従って、赤血球は塩化アンモニウム-塩化カリウム溶解緩衝液 (ACK; Thermoscientific、米国ウォルサム) によって溶解され、細胞の白い層のみが RNA 保護試薬 (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) で凍結されました。 RNA抽出まで。回腸および結腸の生検は動物の剖検から得られ、分析まで RNAprotect 試薬 (Qigen、ヒルデン、ドイツ) 上で保管されました。バフィーコートおよび臓器サンプルからの RNA 抽出は、RNeasy Mini キット (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を使用して実行されました。得られた全 RNA は、Nanodrop 1000 分光光度計 (Thermo Scientific、米国ウォルサム) によって定量され、cDNA 合成は SuperScript III First-Strand キット (Thermo Scientific、米国ウォルサム) によってすべて製造者の指示に従って実行されました 33。

RT-qPCR アッセイは、PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Scientific、Waltham、米国) を使用して 7500 Fast Real-Time PCR System (Thermo Scientific、Waltham、米国) で行われ、インターロイキン 6 (IL-6) の発現を検証しました。およびインターロイキン 10 (IL-10) 遺伝子。 RefFinderオンラインソフトウェアで計算された発現安定性に基づいて、β-アクチン、GAPDH、およびユビキチンを参照遺伝子として使用しました。各サンプルは、ABI Real-Time PCR 7500 ソフトウェア v.2.3 (Thermo Scientific、ウォルサム、米国) を使用して、標的遺伝子と参照遺伝子からの Ct 値の平均を計算しました。

R®を利用して統計分析を実施しました（Rコアチーム、2019年）。各パフォーマンス結果に対する BEO の効果の仮説をテストするために、反復測定を伴うランダム化された完全なブロック実験計画が実装されました。動物は、3/4 または 5/8 ホルスタイン × Gyr の交雑種として遺伝的組成によってブロックされました。分析された結果は、栄養素の消化率、臓器重量、組織学、第一胃、盲腸、血液パラメーター、および遺伝子発現でした。各治療には 8 つの実験ユニットが割り当てられました。

各結果は、線形混合モデル (パッケージ: nlme) を使用して独立して分析されました。それぞれの独立した結果は、治療、実験週、および治療と週の間の相互作用という固定効果の関数としてモデル化されました。出生時体重と血清 Brix 値を共変量としてテストしましたが、統計的有意性は改善されませんでした。したがって、それらはモデルから除外されました。動物の遺伝的組成がブロック効果として含まれていました。個体差を考慮して、治療中の雄牛の影響をモデルに含めました。すべての結果は、残差対近似値および QQ プロットをそれぞれ使用して、このモデルの必要な仮定を満たすために、分散の均一性と正規性についてテストされました。仮定を満たすために、Box-Cox を使用した変数変換が代用乳摂取量に適用されました。すべてのテストには 95% 信頼区間が採用されました。

摂取量、構造的成長、パフォーマンス、第一胃、血液パラメーターなどの継続的な結果を ANOVA で分析しました。 P 値はフィッシャー検定で生成され、推定周辺平均と SEM は emmeans パッケージで計算されました。カテゴリ別結果の糞便スコアと呼吸スコアは、R パッケージ ARTool に実装されたノンパラメトリック整列順位変換テストを使用して分析されました。

栄養素の消化率、窒素バランス、エネルギー分配器官/内臓の重量とサイズ、器官の組織学、脾細胞の増殖、遺伝子発現など、研究中に単一の測定値を持つ結果は、線形混合モデル (パッケージ nlme) を使用して分析されました。子牛はランダム効果、治療は固定効果でした。

飼料摂取量、パフォーマンス、身体測定値は説明目的で評価され、治療内で差異は見られませんでした。平均受動免疫伝達 Brix 値は 10.4 ± 1.0 でした。初期体重と最終体重はそれぞれ 33.3 ± 3.7 kg と 66.1 ± 4.5 kg で、平均成長は WH、RH、HG でそれぞれ 11.3 ± 3.0、12.1 ± 3.2、17.8 ± 3.7 cm でした。動物の平均スターター摂取量は 0.27 ± 318 kg/日、水摂取量は 1.29 ± 980.5 kg/日でした。 MR 摂取量は 0.75 g/日でしたが、下痢の発生により 2 週目と 3 週目には 0.71 ± 0.022 g/日まで減少しました。

第一胃の pH は、CON と比較した場合、BEO 処理の方が低い値を示しました (P = 0.02、表 2)。 1 週間の効果も観察され、両グループとも 3 週目から 9 週目までに pH 値が 14% 減少しました。第一胃アンモニア態窒素および測定されたすべての VFA には治療の差はありませんでした。しかし、pH で観察されたように、VFA と C2:C3 の比率にも 1 週間の影響があり (P < 0.01、表 2)、動物が成長するにつれてすべての VFA の値が増加し、C2:C3 の値が減少しました。 C2:C3 の比率も治療×週の相互作用を示し、BEO 動物では 3 週目と 5 週目にそれぞれ 28% と 16% 高い値が観察されました。 7 週目と 9 週目では、これらの値に違いが生じました。

盲腸パラメータは、安楽死後の試験の最終日にのみ評価されました。酪酸値については例外を除き、すべての評価パラメーターについて治療群内で差異はありませんでした（P = 0.05、表 2）。酪酸値は BEO 群で 76% 高い値を示しました（P = 0.05、表 2）。

すべての代謝パラメータ（BHB、尿素、ブドウ糖）およびホルモンパラメータ（IGF-1）については、治療内で差はありませんでした（P > 0.05、表 3）。しかし、これらのパラメーターはすべて 1 週間の効果を示し (P < 0.01、表 3)、動物が成長するにつれて濃度値が増加しました。血球像に関しては、週を通して赤血球サイズの違いのみがあり、1 週目から 9 週目までの MCV の減少が見られました (P = 0.04、表 3)。白血球数に対する好酸球数の治療効果が観察され、BEO 群では 2.4 倍低い値でした (P = 0.04、表 3)。白血球数に対する週の影響に関しては、年齢は好酸球数、分節化好中球数、リンパ球数、PLR、およびNLRに影響を及ぼし、1週目から9週目までの差異が観察されました。分化好中球については、治療×週の有意な相互作用がありました（P = 0.04)、ここで、BEO 動物は CON 動物と比較して 5 週目に 50% 多くの細胞を持っていましたが、他の週では差はありませんでした。

総管の見かけの消化率と窒素バランスは、試験の終了後 56 日目から 60 日目まで実施されました。DM、OM、総エネルギー、CP、および EE の消化率は、治療間で差はありませんでした (P > 0.05、表 4)。窒素バランスに関連する結果も、治療間で同様の値を示しました (P > 0.05、表 4)。

最終体重に影響を与えないように、安楽死は摂食前の朝に実施した。空体重については治療間で差はありませんでした (P = 0.12、表 5)。評価された臓器のほとんどは、膵臓、気道、小腸を除き、治療間で統計的に類似していました。 BEO 動物の膵臓は、CON と比較して 30% 重かった (P = 0.05、表 5)。肺および気管は、BEO と比較した場合、CON 動物で 11% 重かった (P = 0.03、表 5)。さらに、腸の長さに差がないことに加えて、小腸は BEO 動物の方が 16% 重かった (P = 0.03、表 5)。

回腸絨毛の高さを除いて、消化管の発達と組織学に差異はありませんでした（P > 0.05、表 6）。 BEO の動物は、CON と比較して 25% 高い絨毛を示しました (P = 0.02、表 6)。

細菌抗原に対する細胞応答に対するサプリメントの効果を評価するために、脾細胞増殖アッセイを実施しました。脾臓細胞を、大腸菌抗原抽出物およびリポ多糖でインビトロで刺激した。 EO の潜在的な増殖阻害を検証するために、プロテインキナーゼ C (PKC) を介した細胞増殖活性化因子として PMA を使用しました。しかし、試験したすべての治療下で脾細胞の増殖に差はありませんでした (表 7)。

遺伝子発現は、生後 30 日および 60 日の白血球 (バフィーコート)、および生後 60 日の回腸および結腸で評価されました。これらのサンプルは、この論文の以前の統計結果と我々の以前の結果 22 に基づいて選択され、評価された遺伝子はインターロイキン 6 (IL-6) と 10 (IL-10) でした。これらの遺伝子は、インターロイキン 6 (IL-6) と 10 (IL-10) でした。これらは、インターロイキン 6 (IL-10) で治療後の炎症反応と免疫調節に関連しているからです。 BEO34、35。軟膜、回腸、または結腸におけるIL-6およびIL-10の相対的な遺伝子発現については、治療内で差はありませんでした（P > 0.05、表8）。 IL-6およびIL-10の相対的な遺伝子発現は、軟膜において時間の経過とともに増加しましたが、有意ではありませんでした(P > 0.05、表8)。

人工添加物に代わる代替品の研究と使用は、特に成長促進剤としての抗菌剤が動物生産と公衆衛生にとって懸念事項になってから、広く増加しています2,36,37。 EO は広範囲の抗菌特性を示し、さまざまな種の成長と健康状態を改善します 38,39,40。他の種への EO 補給が GIT 酵素活性の改善と腸内環境の維持にプラスの影響を及ぼしたことがすでに示されています 41。しかし、若い乳用子牛の EO と腸の発達と免疫機能に対する EO の影響を評価するデータはまだ少ないです。したがって、本研究は、EO研究をさらなるステップに進め、臓器発達と免疫機能に対するEO補給の影響を定量化することを目的としました。私たちの主な発見は、膵臓と小腸の重量、回腸の組織学、および盲腸酪酸の増加に対するプラスの影響でした。

摂取量とパフォーマンスは、前回の研究で女性から得られたのと同じパターンを示しました22。子牛の飼育の主な目標は、離乳時の体重を2倍にすることであり、今回の試験ではそれが達成された。しかし、EOを補給した動物の摂取量と成績結果については議論の余地があり、流動食を通じて天然添加物を補給する研究は不足しています。私たちの試験では、メーカーの推奨に従い、1.0 g/日の投与量を 2 回の食事に分けて研究しました。

GIT に対する EO 補給の影響を評価する場合、第一胃と盲腸のパラメータに違いが見つかり、BEO 動物は 3 週目と 5 週目に第一胃の pH が低く、盲腸の酪酸が高く、第一胃の C2:C3 比率が高かったことが知られています。胃腸管のさまざまな部分の VFA 濃度は、局所微生物叢の直接的な機能に関連しています。したがって、第一胃および腸内細菌叢に変化をもたらす添加剤は、VFA および乳酸プロファイル、ひいては第一胃 pH17.42 の変化を引き起こす可能性があります。これまでの研究では、EOを補給した子牛の腸内微生物叢にはより有益な微生物が存在することが示されており18、一部のEOには神経活動があり、動物の行動を変化させる可能性があることが示されている43。緑茶抽出物またはオレガノ抽出物で処理された離乳前のジャージー子牛は、対照群と比較して 1 週間以内に反芻の開始が予測されます 44。さらに、他の種に関する研究では、EO の補給により、酪酸生成菌として知られる胃腸共生細菌が増加することが示されています 45,46。したがって、この AGV の含有量が高いほど、腸の発達と免疫応答の調節が促進される可能性があります 47。反芻動物では、VFA のピーク濃度は第一胃で発生し、二番目に高い濃度は盲腸で見られ、そこで繊維のさらなる消化が起こります 48。局所微生物叢によって生成される盲腸酪酸塩は、結腸細胞に対する主要なエネルギー栄養素として機能し、遺伝子発現、細胞分化、組織発達、免疫調節、酸化ストレス軽減、下痢制御などの腸細胞の複数の機能、つまり胃腸管機能を調節します。下部腸が前胃と連絡している可能性があり、これは下部腸内の栄養素がその後の前胃における適応を引き起こす可能性があることを意味します49。この理論は、第一胃の転帰に対する我々の試験の影響において、なぜ EO が MR に与えたのかを説明できるかもしれない。技術的には、EO は流動食を通じて与えられるため、その摂取は食道溝を通過して第三胃と第四胃に到達します。したがって、EO は腸の発達にのみ影響を与えると予想されました。

さらに、GIT は生後 1 週間の間に栄養供給を感知し、肝臓や膵臓などの消化に寄与する他の臓器と通信します 49。この操作は、群れ内での動物の将来のパフォーマンスにとっても重要です。腸、特に回腸にはパイエル板とも呼ばれるリンパ結節があり、「免疫センサー」として重要な役割を果たし、上皮修復の促進や炎症センサーの活性化、恒常性の調節、自然免疫免疫細胞の存在を助けます。ガット50。この関連性はまた、腸管の健康とその免疫細胞の統合と、腸乳腺経路を介して乳腺に起こるような、他の身体部位への細胞の移動も説明します51。したがって、これらの科学的証拠により、腸は免疫系、微生物叢、および病気の行動において重要な役割を果たしていると言っても過言ではありません。免疫機能と粘膜層の発達を刺激し、栄養素の吸収と微生物の活動のクロストークを促進します52。私たちの関連研究 22 では、BEO 動物は糞便スコアのより低い値を示し、この研究での GIT の肯定的な所見を裏付けています。

GIT の化学的な違いに加えて、私たちの研究では、BEO 動物は膵臓と腸がより重く、回腸絨毛の高さがより高く、サプリメントを与えられた動物がより良い GIT 機能と栄養素の消化率を備えている可能性があることを示しています。膵臓が重いということは、酵素の生産量が多くなり、代謝がより活発になり、この臓器の活動が増加していることを示しています53。食事は、膵臓の発達と機能に影響を与える可能性があり 54、さらに GIT 微生物叢、ひいてはこの臓器の機能にも影響を与える可能性があることが知られています 55。膵臓酵素の分泌の増加は、酵素を使用するための腸の適応を示唆しており、酪酸盲腸で見られる違いを裏付けています。さらに、腸の重さは水分含量または細胞増殖による可能性があることがわかっているため、回腸で見つかった組織学的差異は、腸の重さは細胞含量の増加によるものであり、組織の吸収に影響を与えていることを示しています。したがって、BEO 動物には EO の食餌効果があり、膵臓の重量、腸の発達、代謝にプラスの影響を与えました。したがって、栄養素の消化率に関する違いが予想されましたが、見つかりませんでした。

この試験で見つかった消化率の結果は、以前に報告された正常範囲内でした56、57、58。私たちの予想に反して、両方のグループの消化率は同様でした。インビトロでの消化率を試験したオレガノ EO のさまざまな含有率により、含有率が高いと消化率と第一胃パラメータに悪影響を与える可能性があることが以前に記載されました。しかし、中央値の封入物は第一胃パラメータや局所微生物叢を有益に改変し、栄養素の消化率を高める可能性があります59。授乳牛で試験したところ、オレガノの葉の補給は第一胃パラメータや見かけの栄養素の消化率に変化はありませんでしたが、DMI が減少し、飼料効率が向上しました60。若い子牛の場合、ペレット状の子牛スターターに EO とプレバイオティクスを組み合わせたものを使用すると、DM、CP、ADF、NDF、デンプン、ミネラルの総消化管消化率が向上しました56。また、EO にスターターでモネンシンを補充すると、EO は総栄養素の消化率に大きな影響を及ぼし、モネンシンを補充すると相乗効果が得られることが実証されました 57。違いが見られないのは、サプリメントの投与経路、投与量、その他の添加物、およびそれらの相互作用が原因である可能性があります。あるいは、動物が栄養面で問題を抱えていないことが原因である可能性があります。この試験で消化率が向上したとき、つまり 8 週目では、子牛の第一胃がより発達し、より多くのスターターを食べていたことを覚えておくことも重要です。したがって、栄養素の摂取割合はスターターの方が高かった。前に示したように、スターターの形態と炭水化物源は総消化管に影響を与えます58。この試験における EO は流動食によって補給されたため、消化率と通過率がより高い飼料となりました。さらに、私たちの試験では消化率に対する有益な影響も有害な影響も見つかりませんでした。胃腸管の発達に対するEOの補給と栄養素の消化と吸収への影響をよりよく理解するには、消化率の試験は健康イベントの前後に行われるべきであり、また動物には栄養負荷を与える必要があります。

しかし、栄養素の利用に違いがないことに加えて、EOの補給は正常な腸内細菌叢の制御と維持に役立ち、結果として子牛の発育に役立つ可能性があります。ヒトを対象としたこれまでの研究では、EO が腫瘍壊死因子 (TNF) や IL-6 などの炎症経路に関与する因子を調節し、炎症性疾患の治療に役立つことが示されています 61。 IL-6 は体の防御に寄与するメディエーターであり、感染症や組織損傷に反応して生成されます。これは急性炎症期を刺激し、造血と免疫機能を助け、多くの非免疫細胞の分化と増殖を促進し62、良好な反応と考えられており、胃腸管粘膜の恒常性の達成を助けます63。一方、ストレス（離乳、輸送、病気）、飼料摂取量の変化、脱水、または経口抗菌薬の使用によって腸内微生物叢が破壊されると、腸内細菌叢の異常が発生し、ILなどの炎症性タンパク質の増加につながります。 -6およびTNF7,64。この腸内細菌叢の異常がさらに広範囲に及ぶと、重度の炎症と「リーキーガット」と呼ばれる状態が引き起こされ、腸細胞の密着結合がうまく機能せず、腸内細菌が血流に漏出し、肝臓のスイッチが切り替わります。代謝器官や免疫器官に影響を与え、動物の成長と能力の低下を引き起こします63,65。したがって、適応免疫系の発達は腸内微生物叢によって調整されており、病気への抵抗力にとって重要です6,7。また、酪酸塩の増加は良好な反応を誘導し、炎症反応を抑制し、未熟な T 細胞の Treg 細胞への変換を誘導し、炎症細胞をブロックし、分泌型 IgA 産生やその他の抗菌ペプチドを活性化する IL-10 の産生を促進します。 GIT 防御メカニズム 63. しかし、慢性的または強いストレス下にある動物では、免疫細胞数に差があり、好酸球が多く、白血球およびIL-6のレベルが低い傾向があります。

この試験では白血球数の違いが見つかりました。しかし、我々は、栄養補給された動物の白血球数がより高いことをすでに観察しています22。これは、ストレスにさらされた動物では白血球数が減少するという他の発見と裏付けられており66、EO補給の免疫学的効果を証明しています。好酸球に関しては、好中球と同じ食作用および代謝機能を持つ顆粒球細胞ですが、寄生虫を殺し、特定の種類のアレルギーに対処する上で重要な役割を果たします67。 BEO 動物の好酸球の減少が数週間続いたことも、EO 補給のプラスの免疫学的効果のさらなる証拠を追加する可能性があります。好酸球は局所防御を担当し、GIT および呼吸器組織に存在し、生物学的機能と恒常性の維持に重要な役割を果たしていることに言及することも重要です 68。私たちの結果を観察すると、EO の補給は胃腸管の発達だけでなく気道にもプラスの影響を与えたことがわかります。これまでの研究では、好酸球媒介の炎症よりも植物の二次成分にプラスの影響を与えることが示されています69。血液学的パラメータと好中球に関しては、種および年齢の正常範囲内でした70,71。

この試験では、呼吸器疾患と肺硬化領域は測定されませんでした。しかし、CON グループの肺はより重く、これは以前の呼吸器疾患と結合組織の上皮の置換の名残である可能性があり、組織がより重く密度が高くなった可能性があります。この違いは、器官のフィブリン蓄積、治癒、リモデリングを調節する気道における好酸球の役割と相関している可能性があります68。したがって、BEO 動物は組織治癒が良好で、酸化ストレスが少なく、局所的な炎症が少ない可能性があります 35。したがって、気道が軽くなります。慢性的または激しいストレスにさらされている動物では、免疫細胞数に差があり、好酸球が多く、白血球およびIL-666のレベルが低い傾向があります。我々の以前の研究における BEO 動物は、評価週間内の呼吸スコアの差が低く、白血球数が高かったため 22、今回の研究の呼吸器および血液の結果は、BEO 補給の免疫学的効果を証明しました。

さらに、グループ間の好酸球と器官の違いにより、サイトカインと炎症反応の違いが見つかることが期待されました。炎症誘発性サイトカイン (TNF および IL-6) と抗炎症性サイトカイン (IL-10) は年齢とともに増加する傾向があることが知られています 7。しかし、経時的なわずかな増加以外に、生後 30 日と 60 日の間の IL-6 と IL-10 のバフィーコート分析では差は見られず、治療間に差も見つかりませんでした。これは、サンプルの収集間隔が 4 週間しかなかったためである可能性があります。

回腸と結腸の IL-6 および IL-10 遺伝子発現に関しては、治療間で類似していますが、BEO 動物では回腸に組織学的差異があり、盲腸に酪酸含量が高いため、差異が見つかると予想されました。私たちはこれらの変数をテストする統計力を持っており、腸内微生物叢が RNA の変化や発現と相互作用し、影響を与えるという証拠があります 72。しかし、バフィーコートの結果でも引用されているように、遺伝子発現の違いを見つけるために間違った時点でサンプルを収集した可能性があります。これは、脾細胞の増殖と刺激に差がなかった理由も説明できます。脾臓は、リンパ球やマクロファージなどのさまざまな免疫細胞を備えた大きな免疫臓器でもあります30。したがって、サプリメントを与えられた子牛は、LPS、PMA、大腸菌抽出物に対する反応性を高め、自然免疫反応を誘導すると予想されました。しかし、この反応は IL-6 分泌の能力と相関している可能性があるため、IL-6 は急性期に分泌され、他のインターロイキンはリンパ増殖に関連しており、このパラメーターには差異は見出されず 66、両方の結果は相互に相関しています。私たちの試験で使用された脾臓細胞は、健康で急性ストレスにさらされていない生後 60 日の子牛からのものでした。この補給によって促進される免疫調節効果を検証するには、EO の濃度とサンプル収集時間を変えて新しい実験を行う必要があります。また、免疫学的反応、サプリメントが新生児疾患の克服にどのように役立つか、血球の挙動、発病時期前後の遺伝子発現、特に EO を補充した子牛の微生物叢の挙動の有意な違いを検出するために、健康および病理学的課題もテストする必要があります。

MR 内で離乳前の雄子牛に EO を与えることは、子牛の消化管、特に下部消化管の発達を改善し、生後早期の健康課題に対する免疫細胞の反応を改善するための有望な代替策となる可能性があります。この実験データベースは、流動食を通じて若い子牛に EO を給餌した結果を改善します。今後の研究は、異なる EO の給与、最適な投与量、その与え方、および若い乳用子牛の腸内細菌叢への影響をよりよく理解し、評価するために行われる必要があります。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、補足情報ファイルに含まれています。

精油群のブレンド

β-ヒドロキシ酪酸

大腸菌抽出物コントロール

体重

対照群

粗タンパク質

消化可能なエネルギー摂取量

乾物

大腸菌抽出物

エーテル抽出物

エッセンシャルオイル

エネルギー便排泄

総エネルギー摂取量

代替乳総エネルギー

拒否総エネルギー

スターター総エネルギー

尿によるエネルギー損失

消化管

ヘモグロビン

心臓周囲径

大腸菌リポ多糖抽出物

平均赤血球ヘモグロビン濃度

平均微粒子値

代謝可能エネルギー摂取量

有糸分裂指数

代用乳

代謝可能体重

栄養便の回収

栄養素の摂取

好中球とリンパ球の比率

アンモニア態窒素

尿中窒素

有機物

パックされたセルの体積

血小板リンパ球比率

ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート増殖のポジティブコントロール

赤血球数

尻の高さ

腫瘍壊死因子

揮発性脂肪酸

ホワイターの身長

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著者らは、このプロジェクトに資金を提供してくれた国家科学技術開発評議会 (CNPq、ブラジリア、ブラジル)、ブラジル農業研究公社 (EMBRAPA)、国立科学技術動物科学研究所 (INCT-CA)、Adisseo Company に感謝します。

この論文は、ブラジル農業研究公社 (EMBRAPA)、Adisseo Company (プロジェクト番号: 20500.18/0005-2)、Conselho Nacional de Desenvolvimento Centífico e Tecnológico (CNPq、ブラジリア、ブラジル)、および Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Ciência Animal ( INCT、ヴィソーザ、ブラジル）。これらの著者の具体的な役割は、「著者の貢献」の声明に明記されています。資金提供者は、研究計画、データ収集と分析、出版の決定、原稿の準備において何の役割も果たさず、財政的支援のみを提供しました。

ミナスジェライス連邦大学獣医学部動物科学科、ベロオリゾンテ、ミナスジェライス州、30161-970、ブラジル

ジョアナ・P・カンポリーナ、サンドラ・ゲステイラ・コエーリョ、アンナ・ルイザ・ベッリ、ルイス・F・マルティンス・ネベス

Embrapa Dairy Cattle、ブラジル農業研究法人 (EMBRAPA)、ジュイスデフォーラ、MG、36038-330、ブラジル

フェルナンダ・S・マチャド、ルイス・GR・ペレイラ、ティエリー・R・トミッチ、ワネッサ・A・カルヴァーリョ、レイチェル・MP・ダイバート、ダニエレ・R・L・レイス、マリアナ・M・フィールズ

ラブラス連邦大学獣医学部、ラブラス、ミナスジェライス州、ブラジル

スエリー・F・コスタ

アディセオ、カンピナス、サンパウロ、ブラジル

アレッサンドラ・L・ヴォールルイス & デヴィッド・V・ジェイコブ

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転載と許可

Campolina、JP、Coelho、SG、Belli、AL 他。エッセンシャルオイルのブレンドが乳牛の代謝、消化率、器官発達、遺伝子発現に及ぼす潜在的な利点。 Sci Rep 13、3378 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-30088-y

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受信日: 2022 年 8 月 25 日

受理日: 2023 年 2 月 15 日

公開日: 2023 年 2 月 28 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30088-y

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